2.อุปกรณ์และเครื่องมือที่ใช้

อุปกรณ์และเครื่องมือที่ใช้

อุปกรณ์ที่ใช้กับงานเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อค่อนข้างมีมากชนิด การจัดวางเครื่องมือต้องคำนึงถึงความสะดวกใน การใช้ต่อพื้นที่ให้เกิดประโยชน์มากที่สุด
ถ้ากำหนดชนิดของเครื่องมือตามตำแหน่งของการใช้งานจะแบ่งออกเป็น 3 ห้องใหญ่ๆ คือ
   1. ห้องเตรียมอาหาร
   2. ห้องตัดเนื้อเยื่อ
   3. ห้องเลี้ยงเนื้อเยื่อ
   ภายในแต่ละห้องจะมีอุปกรณ์และเครื่องมือที่ใช้งานเป็นประจำ แตกต่างกัน ไปตามลักษณะงานดังนี้
   (1) ห้องเตรียมอาหาร เป็นห้องที่ใช้เก็บสารเคมีและวัสดุอุปกรณ์เพื่อการชั่งสาร หรือผสมอาหาร หม้อนึ่งความดันไอ ตู้อบความร้อนแห้ง ดังนี้
   1.1 สารเคมี จัดวางในตู้หรือบนชั้นวางของอย่างเป็นระเบียบเป็นหมวดหมู่หรือตามอักษรที่สำคัญ ควรอยู่บริเวณเดียวกับที่วางเครื่องชั่ง
   1.2 เครื่องชั่ง เครื่องวัดความเป็นกรด-ด่าง ควรวางอยู่บนโต๊ะที่มั่นคงไม่สั่นสะเทือนง่าย
   1.3 เครื่องแก้วและเครื่องมืออื่นๆ ควรมีที่เก็บมิดชิด และไม่ห่างจากอ่างน้ำมากนัก
   1.4 อ่างน้ำ ใช้สำหรับล้างทำความสะอาดเครื่องมือต่างๆ เพื่อความสะดวกต่อการปฏิบัติงาน อาจอยู่มุมหนึ่งของบริเวณห้อง
   1.5 บริเวณเตรียมอาหาร ควรเป็นโต๊ะหรือพื้นที่ที่มีความสูงพอที่จะปฏิบัติงานในลักษณะยืนหรือนั่งก็ได้
   1.6 เครื่องกรองน้ำ อาจใช้เครื่องกรองน้ำดื่มตามบ้านได้
   1.7 เครื่องชั่ง มี 2 แบบ คือ เครื่องชั่งอย่างละเอียด และเครื่องชั่งอย่างหยาบ
   -- เครื่องชั่งอย่างละเอียด สามารถชั่งได้เป็นมิลลิกรัม หรือทศนิยม 4 ตำแหน่ง ใช้สำหรับชั่งสารเคมี วิตามิน และสารควบคุมการเจริญเติบโต ซึ่งใช้ปริมาณน้อยมาก
   -- เครื่องชั่งอย่างหยาบ ชั่งได้เป็นกรัม หรือทศนิยม 2 ตำแหน่ง ใช้สำหรับชั่งสารเคมีที่ใช้ปริมาณมาก เช่น วุ้น และน้ำตาล
   1.8 เครื่องวัดความเป็นกรด-ด่าง (pH-meter) ใช้วัดค่าความเป็นกรด-ด่าง ของอาหารสังเคราะห์ควรอยู่ที่ระดับ 5.6
   1.9 เครื่องคนสารละลาย ใช้สำหรับคนสารละลายเมื่อใส่แท่งคนไฟฟ้า (Magnetic stirror) ขณะเตรียมอาหาร
   1.10 เตาต้มอาหาร อาจเป็นเตาไฟฟ้าหรือเตาแก๊ส ใช้สำหรับต้มอาหารเพื่อให้วุ้นละลาย
   1.11 ตู้อบความร้อนแห้ง (Hot air oven) ใช้ในการอบฆ่าเชื้อเครื่องแก้วและอุปกรณ์ในการตัดย้ายเนื้อเยื่อ โดยใช้อุณหภูมิ 180 องศาเซลเซียส
เป็นเวลา 2-3 ชั่วโมง
   1.12 เครื่องแก้ว ปัจจุบันนิยมใช้เป็นพลาสติกเพราะลดความเสียหายจากการแตกร้าวได้ค่อน ข้างมาก
   -- ฟลาสค์หรือขวดรูปชมพู่ ขนาด 50-1,000 มิลลิลิตร
   -- บีกเกอร์ ใช้ปรับปริมาตรของอาหาร ขนาด 20-1,000 มิลลิลิตร
   -- กระบอกตวง ขนาด 5-1,000 มิลลิลิตร
   -- ไปเปต ใช้ดูดสารละลายปริมาณน้อย ขนาด 0.1-10 มิลลิลิตร
   1.13 หม้อนึ่งความดันไอ (Autoclave) ใช้นึ่งฆ่าเชื้อจุลินทรีย์ในอาหารวุ้นโดยใช้ความร้อน ที่อุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส ความดัน
15 ปอนด์ต่อตารางนิ้ว เป็นเวลา 15-20 นาที อาจเป็นแบบหม้อไฟฟ้าอัตโนมัติ หรือเป็นแบบที่ใช้ความร้อนจากเตาแก๊ส มีทั้งแบบแนวตั้งและแนวนอน
หม้อแบบแนวนอนจะมีความจุมากกว่าหม้อแบบแนวตั้ง และมีราคาค่อนข้างสูง
   -- หม้อนึ่งความดันไอแบบใช้ไฟฟ้าแนวตั้ง เป็นแบบที่ได้รับความนิยม มีใช้ในห้องปฏิบัติการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อเกือบทุกแห่ง
   -- หม้อนึ่งความดันไอ แบบใช้ไฟฟ้าแนวนอน สามารถนึ่งอาหารได้ปริมาณมากกว่าหม้อ แบบแนวตั้ง
   -- หม้อนึ่งความดันไอ แบบใช้แก๊ส ใช้หลักการเดียวกับหม้อนึ่งเชื้อเห็ดประสิทธิภาพการทำงานสูงหรือต่ำขึ้นอยู่กับผู้ปฏิบัติงาน สามารถควบคุมอุณหภูมิและความดันให้คงที่ตามกำหนดเวลา ได้หรือไม่

   (2) ห้องตัดเนื้อเยื่อ เป็นห้องที่มีเจ้าหน้าที่ปฏิบัติงานมากที่สุดศูนย์รวมของกิจกรรมเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อจะอยู่ในห้องนี้ ควรเป็นห้องที่มีระบบป้องกันการ
ปนเปื้อนของเชื้อ ผิวพื้นห้องทุกด้านทั้งฝาผนัง พื้นห้อง ควรมีผิดเรียบมัน ไม่เป็นที่สะสมของฝุ่นละออง ทำความสะอาดง่าย วัสดุอุปกรณ์ประกอบไปด้วยตู้
ตัดเนื้อเยื่อ จำนวนมากน้อยเป็นไปตามปริมาณการผลิตของแต่ละแห่ง ดังนี้
   2.1 ตู้ตัดเนื้อเยื่อ เป็นตู้ปลอดเชื้อที่ใช้กับงานตัดย้ายชิ้นพืช มีระบบการหมุนเวียนของอากาศภายในตู้ที่สะอาด ปราศจากเชื้อจุลินทรีย์ตลอดเวลา
ของการปฏิบัติงาน ด้วยระบบการถ่ายเทอากาศผ่านแผ่นกรองที่มีรูพรุน ขนาดเล็กประมาณ 0.3 ไมครอน ซึ่งเชื้อจุลินทรีย์ไม่ สามารถเล็ดลอดผ่านได้
ทั้งนี้ควรเช็ดทำความสะอาดตู้ทั้งก่อนปฏิบัติงานและหลังเลิกงานในแต่ละวัน โดยเช็ด ออกด้านนอกตู้เสมอด้วยแอลกอฮอล์ 70% รวมทั้งการเปลี่ยนแผ่นกรอง
เชื้อจุลินทรีย์ตามกำหนดเวลาเพื่อรักษา ประสิทธิภาพความเป็นตู้ปลอดเชื้อ
   2.2 วัสดุหรือเครื่องมือที่ใช้ตัดเนื้อเยื่อ ได้แก่
   - มีดผ่าตัด นิยมใช้ด้ามมีดเบอร์ 3 กับใบมีดเบอร์ 10 หรือ11
   - ปากคีบ (forcepts) ใช้หนีบจับชิ้นพืช มีขนาดความสั้นยาว ต่างกันไปขึ้นกับความสะดวกในการปฏิบัติงาน
   - ตะแกรงสำหรับวางมีดและปากคีบ
   - ตะเกียงแอลกอฮอล์
   - จานรองหรือกระดาษ ที่ผ่านการนึ่งฆ่าเชื้อแล้วใช้รองตัดชิ้นเนื้อเยื่อ
   วัสดุเหล่านี้ก่อนนำมาตัดเนื้อเยื่อต้องทำการฆ่าเชื้อจุลินทรีย์โดยการนึ่งฆ่าเชื้อด้วยหม้อนึ่งความดันไอ หรือการอบความร้อนแห้งภายหลังสิ้นสุดการปฏิบัติงาน
ทุกครั้งต้องนำเครื่องมือเหล่านั้นมาล้างให้สะอาดด้วยน้ำยาล้างจาน เช็ดให้แห้งห่อด้วยกระดาษตะกั่วแล้วจึงนำไปฆ่าเชื้อจุลินทรีย์เพื่อการนำมาใช้ใหม่ในครั้งต่อไป

   2.3 อุปกรณ์อื่น ๆ ได้แก่
   1. เก้าอี้มีพนักสำหรับพนักงานตัดเนื้อเยื่อ
   2. รถเข็นสำหรับวางขวดอาหาร ขวดเนื้อเยื่อพืช
   2.4 อุปกรณ์ดับเพลิง ควรมีประจำทุกชั้นและทุกห้อง โดยเฉพาะห้องตัดเนื้อเยื่อเพราะขณะปฏิบัติงาน มีการลนไฟฆ่าเชื้อวัสดุอุปกรณ์ตลอดเวลา อาจเกิดอุบัติเหตุไฟลุกไหม้ภายในตู้ได้

   (3) ห้องเลี้ยงเนื้อเยื่อ เป็นห้องปลอดเชื้อ ควบคุมอุณหภูมิให้อยู่ระหว่าง 25-25 องศาเซลเซียสใช้เป็นสถานที่วางขวดเนื้อเยื่อพืช
เป็นห้องที่ไม่ควรอนุญาตให้ผู้ที่ไม่มีหน้าที่เกี่ยวข้องเข้าออกโดยเด็ดขาดเพราะจะทำให้เกิดการปนเปื้อนของเชื้อจุลินทรีย์ในขวดเนื้อเยื่อพืชอาจทำให้เกิดความเสียหาย
กับต้นพันธุ์พืชในภาพรวมได้ อุปกรณ์ที่สำคัญที่ติดตั้งอยู่ในห้อง ได้แก่
   3.1 ชั้นวางเนื้อเยื่อ วัสดุที่ประกอบเป็นชั้นอาจทำด้วยไม้ เหล็กฉาก แสตนเลส หรืออลูมิเนียม เป็นต้น ขนาดกว้าง x ยาว x สูง ประมาณ
60 x 125 x 200มีชั้นวาง 5 ชั้น แต่ละชั้นห่างกันประมาณ 30 เซนติเมตร โดยส่วนที่ทำเป็นพื้นควรจะเป็นกระจกหรือฟอร์ไมก้าสีขาว หรือเป็นตาข่ายโปร่ง มีหลอดไฟฟ้าที่ ให้ความสว่างแก่พืชเพื่อการสังเคราะห์แสง นิยมใช้หลอดไฟที่เรียกว่า Grolux เพราะมีคุณสมบัติของการให้ แสงสีแดง ซึ่งเหมาะกับการ
สังเคราะห์แสงของพืช แต่หลอดชนิดนี้มีราคาค่อนข้างสูงจึงอาจใช้หลอดไฟฟลูออเรสเซนต์ชนิดธรรมดาที่ใช้กับอาคารบ้านเรือนก็ได้ทั้งนี้การติดตั้งหลอดไฟ
ควรให้หลอดอยู่ห่างจากชั้นวางเนื้อเยื่อในระยะประมาณ 20 เซนติเมตร และแต่ละหลอดอยู่ห่างกันประมาณ 30 เซนติเมตร เพื่อให้ได้ความเข้มแสง
2,000-3,000 ลักซ์ เมื่อวัดด้วยเครื่องมือ ที่เรียกว่า Lux meter โดยเปิดไฟติดต่อกันนาน 16 ชั่วโมงต่อวัน จึงควรมีนาฬิกาควบคุมการปิด-เปิดไฟฟ้า (timer) ด้วย
   3.2 เครื่องเขย่าแบบโยก ใช้สำหรับเนื้อเยื่อพืชที่เลี้ยงในอาหารเหลว มีลักษณะการเคลื่อนที่ในแนวขนานกับพื้นโลกอัตรา 100-150 รอบต่อนาที เป็นการ
เพิ่มออกซิเจนลงไปในอาหารเพื่อให้เนื้อเยื่อพืชได้รับออกซิเจนอย่างเพียงพอต่อการเจริญเติบโต


  กิจกรรมภายในห้องเตรียมอาหาร

   การปฏิบัติงานภายในห้องเตรียมอาหาร จะเริ่มต้นจากการชั่งสารตามสูตรอาหารที่ต้องการ ผสมเป็นสต็อกสารละลาย ปรับค่าความเป็น
กรด-ด่าง หลอมอาหาร และบรรจุขวดก่อนนึ่งฆ่าเชื้อเพื่อรอการนำไปใช้ตามลำดับดังนี้
   1. ชั่งสารเคมี ต้องการความแม่นยำสูง โดยเฉพาะสารเคมีที่ใช้ปริมาณน้อย จึงต้องชั่งด้วยเครื่องชั่งอย่างละเอียด สามารถชั่งได้ทศนิยม 4 ตำแหน่ง
   2. สำหรับสารเคมีที่ใช้ปริมาณมาก จะชั่งด้วยเครื่องชั่งอย่างหยาบ ชั่งได้ทศนิยม 2 ตำแหน่ง เช่น น้ำตาล หรือวุ้น
   3. ผสมสารเคมี ต้องทำให้ส่วนประกอบของสารเคมีละลายผสมเข้ากันได้หมด โดยใช้เครื่องคนสารละลายร่วมกับแท่งคนไฟฟ้า
   4. วัดความเป็นกรด-ด่าง (pH) ให้ปรับใช้ที่ระดับ 5.6 ซึ่งเหมาะสมต่อการที่พืชจะนำธาตุอาหารไปใช้ในการเจริญเติบ แต่ในอาหารบางสูตรอาจใช้ที่ระดับ pH 5 เช่น อาหารกล้วยไม้
   5. หลอมอาหาร เมื่อผสมอาหารเสร็จเรียบร้อยแล้ว นำมาหลอมวุ้นให้ละลายบนเตาแก๊สหรือไมโครเวฟก็ได้
   6. กรอกอาหาร ลงภาชนะต่างๆ เช่นขวดหรือถุงหรือกล่องพลาสติก เป็นต้น แต่ภาชนะที่ต้องทนความร้อน และสิ่งที่ต้องระมัดระวังขณะกรอกอาหาร คือ พยายามอย่าให้อาหารเลอะปากภาชนะ เพราะเป็นสาเหตุของการปนเปื้อนจากเชื้อจุลินทรีย์ได้ง่าย
   7. อาหารวุ้นในขวด กรอกอาหารลงขวดขนาด 4 ออนซ์ (ขวดน้ำพริกเผา) ปริมาณอาหารที่กรอกขวดละ 20-25 มิลลิลิตร ปิดฝาให้สนิทนำไปนึ่งฆ่าเชื้อ
   8. อาหารวุ้นในถุง กรอกอาหารลงถุงขนาด 4*6 นิ้ว (ถุงร้อน) ปริมาณอาหารที่กรอกถุงละ30-35 มิลลิลิตร นำไปนึ่งฆ่าเชื้อ
   9. นำอาหารวุ้นเข้าหม้อนึ่งความดันไอ เพื่อนึ่งฆ่าเชื้อ เมื่อเตรียมอาหารเรียบร้อยแล้ว ควรทำให้ปลอดเชื้อภายในวันเดียวกัน ด้วยหม้อนึ่งความดันไอที่อุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 15 ปอนด์ต่อตารางนิ้ว เป็นเวลา 15-20 นาที (เวลาอาจปรับเปลี่ยนตามขนาดของภาชนะ และปริมาตรของอาหาร) เมื่อนึ่งฆ่าเชื้อเรียบร้อยแล้ว รีบนำอาหารออกจากหม้อนึ่งความดันไอทันทีที่ความดันลดลงเป็น 0 ถ้าเป็นขวดควรปิดฝาให้แน่นเนื่องจากฝาขวดอาจขยายตัว เมื่อผ่านการนึ่งฆ่าเชื้อแล้ว และควรเก็บไว้ประมาณ 1 สัปดาห์ก่อนนำไปใช้ เพื่อตรวจสอบอีกครั้งว่า ไม่มีการปน เปื้อนของเชื้อจุลินทรีย์
  10. สต็อกอาหารวุ้นผ่านการนึ่งฆ่าเชื้อแล้ว เก็บไว้ประมาณ 1 สัปดาห์ ก่อนนำมาใช้


กิจกรรมภายในห้องตัดเนื้อเยื่อ

   จะเป็นการตัดย้ายเนื้อเยื่อไปเลี้ยงบนอาหารใหม่ ซึ่งต้องอาศัยเทคนิคปลอดเชื้อ เจ้าหน้าที่ ประจำห้องปฏิบัติการ ต้องเตรียมตัวให้อยู่ในสภาพที่พร้อมทำงานตามลำดับ ดังนี้
  1. การรักษาความสะอาดด้วยการล้างมือให้สะอาดด้วยสบู่ และสวมชุดปฏิบัติการ ประกอบด้วยถุงมือ ผ้าคลุมผม ผ้าปิดปากปิดจมูก และเปลี่ยนรองเท้าก่อนเข้าห้องปฏิบัติการทุกครั้ง
  2. เช็ดทำความสะอาดตู้ปลอดเชื้อก่อนใช้งานและควรเปิดสวิทซ์ตู้ให้ระบบต่างๆ ภายในตู้ทำงานก่อนปฏิบัติงาน 15-30 นาที
  3. วางอุปกรณ์ที่ใช้ตัดเนื้อเยื่อในตำแหน่งที่เหมาะสมและสะดวกต่อการปฏิบัติงาน
  4. การลนไฟเครื่องมือที่ใช้ปฏิบัติงานเพื่อฆ่าเชื้อจุลินทรีย์ก่อนเริ่มตัดเนื้อเยื่อ
  5. ตัดเนื้อเยื่อปลายยอด apical meristem ในกรณีที่ผลิตปลอดโรค
  6. ตัดเนื้อเยื่อระยะเพิ่มปริมาณภายในตู้ปลอดเชื้อ
  7. นำชิ้นพืชที่ตัดแบ่งวางเลี้ยงบนอาหารในขวดก่อนปิดฝา
  8. ลนไฟปิดปากถุง
  9. ลงบันทึกชนิดพืชและ วัน/เดือน/ปี ที่ตัดย้าย
  10. เนื้อเยื่อพืชพร้อมนำเข้าเรียงบนชั้นในห้องเลี้ยงเนื้อเยื่อที่ควบคุมแสง และอุณหภูมิ

กิจกรรมภายในห้องเลี้ยงเนื้อเยื่อ

  1. นำขวดเนื้อเยื่อพืชที่เปลี่ยนอาหารใหม่ เข้าห้องเลี้ยงเนื้อเยื่อ
  2. ทำความสะอาดชั้นเรียงพืชด้วยแอลกอฮอล์ 70% ก่อนเรียงเนื้อเยื่อพืช
  3. นำถุงเนื้อเยื่อพืชวางเรียงบนชั้นที่มีความเข้มแสง 2,000-3,000 ลักซ์
  4. เนื้อเยื่อพืชระยะเพิ่มปริมาณในขวด
  5. เนื้อเยื่อพืชระยะสุดท้าย (เกิดราก) ในถุง
  6. ตรวจสอบการปนเปื้อนเชื้อจุลินทรีย์หากพบจะต้องเก็บทิ้งทันที หากปล่อยทิ้งไว้จะทำให้สปอร์ของเชื้อราแพร่กระจายออกจากขวดสู่บรรยากาศของห้องได้
  7. คัดเลือกแม่พันธุ์ เพื่อการตัด-ขยาย
  8. บันทึกรายละเอียดและลักษณะของชิ้นพืช
  9. เตรียมส่งพืชเนื้อเยื่อออกปลูกในสภาพโรงเรือน เมื่อต้นพันธุ์พืชเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ ผลิตได้ครบจำนวนตามเป้าหมาย จะถูกจัดเตรียมเพื่อนำออก อนุบาล ในสภาพโรงเรือน

*******************************